前 言
本标准代替GB/T 4789.35-2008《食品卫生微生物学检验 食品中乳酸菌检验》。
本标准与GB/T 4789.35-2008相比，主要变化如下：
——修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。
本标准的附录A为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
—— GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。
1 范围
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。
本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。
2 规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日
期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3 术语和定义
3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria
一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、
双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。
4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
4.1 恒温培养箱：36℃±1℃。
4.2 冰箱：2℃～5℃。
4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。
4.4 天平：感量 0.1 g。
4.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
4.6 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。
5 培养基和试剂
5.1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良 MRS 培养基：见附录 A 中 A.1。
5.2 MC 培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录 A 中 A.2。
5.3 0.5 %蔗糖发酵管：见附录 A 中 A.3。
5.4 0.5 %纤维二糖发酵管：见附录 A 中 A.3。
5.5 0.5 %麦芽糖发酵管：见附录 A 中 A.3。
5.6 0.5 %甘露醇发酵管：见附录 A 中 A.3。
5.7 0.5 %水杨苷发酵管：见附录A中A.3。
5.8 0.5 %山梨醇发酵管：见附录A中A.3。
5.9 0.5 %乳糖发酵管：见附录A中A.3。
5.10 七叶苷发酵管：见附录A中A.4。
5.11 革兰氏染色液：见附录A中A.5。
5.12 莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。
6 检验程序
乳酸菌检验程序见图1。
7 操作步骤
7.1 样品制备
7.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
7.1.2 冷冻样品可先使其在 2℃～5℃条件下解冻，时间不超过 18 h，也可在温度不超过 45℃的条件，解冻时间不超过15min。
7.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取 25 g 样品，置于装有 225 mL 生理盐水的无菌均质杯内， 于 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；或置于 225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min 制成 1:10 的样品匀液。
7.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶
内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成 1:10 的样品匀液。
7.2 步骤
7.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
7.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次 1mL 灭菌吸管或吸头。
7.2.3 乳酸菌计数
7.2.3.1 乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计，选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2 个 MRS 琼
脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃，厌氧培养 48 h±2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要
求在 15min 内完成。
7.2.3.2 双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL样品匀液于莫匹罗星锂盐
（Li-Mupirocin）改良 MRS 琼脂平板，使用灭菌 L 形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。36℃±1℃，厌氧培养 48 h
±2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。
7.2.3.3 嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2
个 MC 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃，需氧培养 48 h±2 h 后计数。嗜热链球菌在 MC 琼脂平板上的菌
落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径 2 mm±1 mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完成。
7.2.3.4 乳杆菌计数
7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
7.3 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落 形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
7.3.1 选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。
7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
7.4 结果的表述
7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）中菌落总数结果。
7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
式中：
N——样品中菌落数；
C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n 1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n 2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可
记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算。
7.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。
7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.5 菌落数的报告
7.5.1 菌落数小于 100 CFU 时，按"四舍五入"原则修约，以整数报告。
7.5.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用"四舍五入"原则修约后，取前 2 位数字，后 面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按"四舍五入"原则修约后，采用两位有效数字。
7.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
8 结果与报告
根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。
9 乳酸菌的鉴定（可选做）
9.1 纯培养
挑取 3 个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板，乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板，置
36 ℃±1 ℃厌氧培养 48 h。
9.2 鉴定
9.2.1 双歧杆菌的鉴定按 GB/T 4789.34 的规定操作。
9.2.2 涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。 嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为 0.5m～2.0m，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。
9.2.3 乳酸菌菌种主要生化反应见表 1 和表 2。
|
